组织培养的基本条件

培养基配制合适的培养基是成功的要素之一。不同种类植物，即使同类植物，对其诱导愈伤组织（脱分化）和诱导再生苗（分化），培养基都有不同。至目前为止，培养基种类已有很多种。一般常用 MS 培养基。但烟草还用修改过的 MS 培养基，即 Nitsch H 培养基脱分化， Nitsch T 培养基分化再生苗。为适应各种植物材料。各种研究及实践应用的需要，可以改用别的培养基，或在所用培养基上，适当改变成分、数量、激素比例，添加各种附加物，如维生素、氨基酸及天然营养物质（椰子乳等）。

配制培养基：按照配方配制（见下表 3 示例）。但应注意：对于用量极

少或需大量应用的试剂，可以预先配制母液。大量元素按 10 倍浓度配成母

液。微量元素按 100 倍配制。其他有机物一般分别按 1 毫克/1 毫升浓度配制。注意：2，4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）应先用少量 95％酒精溶解、激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）需先用 1N 盐酸或氢氧化钾溶液溶解。

配制培养基时，吸取所需数量的各种母液及铁盐溶液混合，加入蔗糖， 用 1N 氢氧化钾溶液调节 pH 至 5.8，再加入溶化的琼脂，定容到 1000 毫升。将培养基分装到培养容器（三角瓶或试管）中，以塑料膜封盖瓶口，如用外包纱布的棉花塞，则还要用牛皮纸封盖瓶口。培养基约占培养瓶容积的 1/5～ 1/4。然后高压灭菌（15 磅，

无菌操作 组织培养中如有细菌或霉菌污染，它们会比植物细胞长得快、而且产生毒性物质，使培养物死亡。因此应进行无菌操作以防止污染。为便于无菌操作，最好用超净工作台，也可用接种室或自制接种箱。除了接种前应用紫外灯照射 20 分钟灭菌外，也可用甲醛加入高锰酸钾熏蒸。以 70％酒精擦拭操作台台面及操作人员双手。对于所用器皿用纸包严或放于金属盒内高压灭菌（同培养基消毒）。也可放置于电热烘箱内，150℃，40 分钟（或120℃，2 小时）。刀、镊子等金属用具在使用前可插于 70％酒精中，用时在酒精灯火焰上消毒，待冷却后使用。

培养条件 一般以 23～28℃为宜，光照条件多用 1000～4000 勒克斯，光源可用荧光、白炽灯管。

主要实验用具及药品 烧杯，量筒，移液管，容量瓶，剪刀，镊子，三角瓶，酒精灯，pH 试纸。显微镜，天平，高压灭菌锅，烘箱，漂白粉或次氯酸钠，70％酒精，吲哚乙酸（IAA），醋酸洋红染液，秋水仙碱，激动素（KT）， 培养基（配方见附表）。

植物器官培养 常用的实验材料为烟草。最好用幼嫩的叶片或茎段，如暂时不用，可用湿纱布包好放入冰箱 5～10℃下保存。如果材料取自于田间， 用自来水洗净、吸干，放入饱和的漂白粉上清液（10％）处理 10～15 分钟； 或 5～15％次氯酸钠中浸泡 5～20 分钟。用无菌水清洗 3～4 次。对于带茸毛、

难于消毒的材料，在水洗后还可用 70％酒精漂洗数秒钟或稍长时间。

为诱导愈伤组织，在无菌条件下将消毒过的材料剪成约 1 厘米大小的片断（注意，材料要有伤口才能长愈伤组织），用镊子夹住，接种于培养基（Nitsch H+2 毫克/升 IAA，0.2 毫克/升 KT 或 MS，4.5 毫克/升 2，4-D，2 克/升水解酪蛋白）。约 2 周左右形成愈伤组织。

为分化再生苗，在接种 1 个月后，将愈伤组织转到分化培养基（Nitsch T+0.5 毫克/升 IAA，2 毫克/升 KT；或 MS： 2.5 毫克/升 KT， 0.5 毫克/升IAA），大约 3 周后，陆续产生幼苗。如果把小苗移入补加 0.2～0.5 毫克/ 升 IAA 的 Nitsch T ，或 MS+110 毫克/升 3-氨基吡啶培养基中，可以使根系发达。当长出数条根， 3～5 片叶时，将幼苗移栽田间。移栽前要打开瓶塞， 在室温下“锻炼” 3～4 天，移栽时取出幼苗，用水洗去根部培养基，然后栽入土中。还可以在移栽后用烧杯或塑料袋罩住幼苗数天。

如不经过愈伤组织，而直接分化苗，可以将烟草叶片接种在 MS+2 毫克/ 升 KT+0.05 毫克/升 IAA 培养基上，约 2～3 周后，叶片可直接分化出芽再发育成小苗。

如要进行快速繁殖，可将烟草苗剪成几段，每段约 3～5 厘米长，包含茎尖或一个腋芽，去掉一些大叶片。接种在 MS+2 毫克/升 KT+0.5 毫克/升 IAA 培养基上。可能直接长出完整的再生苗，这样反复进行能够迅速繁殖大量植株。

愈伤组织可通过继代培养而保存下来。即将长大的愈伤组织，切成直径约 0.7 厘米大小的小块，转接到 NitschH 或 MS+4.5 毫克/升 2，4-D 培养基上。大约每月如此进行一次转接。

花药培养 花药培养成功的关键因素之一是花粉发育时期要合适。一般以单核靠边时期为宜。有的植物所需时期可能略早或略晚些。实验中常用烟草为材料。首先要确定合适花蕾的标准。在烟草中一般以花冠与萼片等长为准。也可通过观察花粉进一步确定。为此，取大小不同的幼嫩花蕾，从中取出花药，置于载玻片上，加一滴醋酸洋红染液，挤压出花粉，染色后在显微镜下观察，以花粉的单核靠边为准选取花蕾。

将选出的合适花蕾，剥去萼片，先用 70％酒精擦拭，或浸泡一下，然后放在饱和的漂白粉上清液中浸泡 10～20 分钟，以无菌水冲洗 3 遍。在无菌条件下用镊子取出花药，收集于无菌培养皿中。注意勿损伤花药，以免诱导出非花粉愈伤组织。然后将花药接种于 Nitsch H 或 1/2MS（全量铁）培养基上。每 100 毫升培养瓶约 20 个花药。

培养的花药由绿色逐渐变褐色。约 3 周后，在其裂口处陆续长出胚状体， 而后发育成小苗。如果改变培养基成分，也可能先产生愈伤组织，再分化小苗。当小苗长至约 5 厘米，未出现真叶及根系前，移至 NitschT 或 MS 培养基上以壮苗。待出现 4～5 片真叶和根系时，即移栽于土壤中。

由花粉发育成的单倍体植株只有配子一组染色体，是不能结实的。因而需要将染色体加倍成二倍体。组织培养中，可能自然加倍，但其频率低。常用的染色体加倍的办法是用秋水仙碱溶液浸泡小苗。当小苗移入 NitschT 培养基前，于无菌条件下，将 0.2～0.4％的秋水仙碱溶液倒入培养瓶中，一般处理 24～48 小时。倒去秋水仙碱液，用无菌水洗 3 次后，再将小苗移至NitschT 培养基继续培养，可能得到一些染色体加倍的再生苗。对于了解再生植株染色体是否加倍成功，可从形态上加以鉴别；单倍体植株株型矮小，

叶片、气孔、花粉粒都小些，不能结实。但最可靠的办法还是制作染色体玻片标本，检查染色体数目。

附表 MS、NitschH 和 NitschT 培养基成分

*铁盐：5.57 克硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）和 7.45 克乙二胺四乙酸二钠

（Na2-EDTA）溶于 1 升蒸馏水中，用时每配 1 升培养基取 5 毫升。