电子显微术

以电子显微镜（以下简称电镜）为工具，揭示样品的亚显微结构的显微科学技术。它包括电镜的研制和使用，以及样品制备技术等。目前已有透射、扫描、超高压和分析等多种电镜。样品制备技术也有许多种，如：超薄切片、冰冻蚀刻、免疫电镜、冰冻超薄切片、电镜细胞化学和放射自显影技术等。电镜即在高真空和高电压条件下，以电子束作为光源、由系列电子透镜或探测器等组装，在荧光屏上成像的电子显微装置。

透射电镜 即电子束穿透样品后，经电磁透镜放大，在荧光屏上成像的电镜。这种电镜的基本构造包括三大部分，即：真空系统、电子光学系统和电气系统。其成像原理是在真空条件下，经过高电压加速的电子束穿透超薄样品时，与样品发生作用。由于样品的密度和厚薄不同，导致电子射线成为不同角度的透过电子和散射电子束流。带有样品信息的电子束流经过中间镜、投影镜等系列电磁透镜放大处理后，最终在荧光屏上成像，以供观察。在荧光屏下方有摄影装置，掀开荧光屏，带有样品信息的电子束流即可使电子胶片感光，记录下样品的信息。

一般透射电镜加高压到 50～120 千伏（KV），可以观察＜0.1 微米（μm）的超薄样品。透射电镜的晶格分辨率已达 1～2 埃（Å）左右，但因制备条件的限制，一般生物样品的分辨率只能达 5～10 埃。目前新型的透射电镜已装有微机控制系统和 TV 系统，可将观察到的信息录相，并在较大的荧光屏上再现，使精细的超微结构明晰易见，便于分析。还可进行立体摄影，以及在观察样品超微结构的同时进行微区元素分析。另外附加扫描装置可同时获取样品表面结构的图象等。透射电镜多用于研究样品的二维超微结构以及电镜免疫标记等。另外冷冻蚀刻、电子探针微区分析和电镜放射自显影等的样品也常用透射电镜来观察。

超高压电镜 即高压可达 2000 千伏以上，电子束可穿透约 10μm 厚的样品的电镜。这种电镜的基本构造和成像原理与透射电镜相似，但需要特制的真空系统和高压电气系统，还要附加特殊的操作控制系统和辐射防护装置等，使其结构较透射电镜更复杂。一般超高压电镜高达 6 米以上，加上耗资高，使一般实验室难以装备。超高压电镜电子束的穿透力极强，分辨率高，除了能观察较厚的样品之外，也能直接观察含水样品，如活细胞，但需将其放入特制的小室中。这一优点为研究活细胞的立体结构和生物事件提供了条件。目前，超高压电镜常用于研究各种非生物材料，如：稀有金属、建筑材料的晶格结构，以及细胞精细的骨架结构等。

扫描电镜 即一种电子探针在样品表面扫描时，激发的带样品信息的二次电子成像的电子显微装置。这种电镜的基本构造包括真空系统、电子光学系统、电子信号收集与处理系统等。其成像原理是在真空条件下，电子探针在样品表面按顺序一行行的扫描时，能激发喷涂在样品表面的金属层放出二次电子等信号。由于样品表面的形貌不同，各位点激发的二次电子的数量亦不同，探测器将带有样品表面信息的二次电子收集起来，并按顺序成比例地转换为视频信号，再经光电倍增管和放大器等处理后，用来调控阴极射线管的电子束强度，最终这种带有样品表面信息的电子束在荧光屏上作同步扫描成像。

一般用扫描电镜看生物样品加电压 10～20 千伏即可，并且可多角度、大

面积的观察样品。其成像立体感强、放大倍数可在几十倍至几十万倍之间随意调节，所以有独到之处。特别是给扫描电镜附加上阴极发光探测系统或 X 射线元素分析谱仪等之后，可使其在显示样品表面的超微结构的同时，又能进行微区的元素分析等综合检测，使其应用价值大大提高。普通扫描电镜的分辨率较透射电镜为低，一般在 30 埃左右，但场发射扫描电镜和扫描透射电镜的分辨率也可达几埃。

电镜样品制备技术 样品制备技术包括的内容非常广泛，现在较常用的技术有：超薄切片术、电镜细胞化学技术、免疫电镜技术、扫描电镜样品制备技术、冷冻蚀刻术、负染术、电镜放射自显影术、电子探针微区元素分析技术，以及生物高分子电镜技术等。下面例举几种常用技术。

超薄切片术这项技术借助精密的超薄切片机，可将极小的样品（其表面积大约相当于一个印刷冒点）切成 300～700 埃的超薄切片，这种薄度相当于将一个直径大约几微米的细胞切为几十片甚至上百片。再将切片捞于特制的金属网上，经重金属染色后，用透射电镜观察。

目前冷冻超薄切片显示出更多的优越性，它是在超薄切片机上附加液氮冷冻控制装置，使切片的整个过程都保持低温冷冻状态。样品制备过程简单，可将取下的材料用液氮或氟里昂迅速冷冻，然后直接拿到冰冻超薄切片机上切片。由于省去了化学固定、脱水、包埋和聚合这一系列繁琐的步骤，大大减少了对超微结构的人工损伤，使观察结果更趋真实。

扫描电镜样品制备技术这一技术不需要包埋和切片，一般过程是：（1）戊二醛固定。（2）系列乙醇脱水。（3）乙酸异戊酯置换。（4）干燥样品。

真空喷金后观察。其中第（4）步很关键，有多种干燥方法，如临界点干燥、冷冻干燥、空气干燥和药物干燥等。本技术广泛用于揭示组织细胞和微生物等生物材料的表面结构，亦可用来研究细胞骨架系统，以及进行免疫标记等。如果附加上能谱仪和计算机系统，在观察样品形态的同时，还能进行该微区的元素分析，另外冷冻割断扫描和激光扫描电镜技术又进一步扩展了应用范围，前者可使细胞内部的立体结构清晰可见；而后者为直接观察活细胞提供了方便。

冷冻蚀刻技术用这种技术能揭示生物膜的内外表面的超微结构。如：细胞膜、细胞内膜、以及人工膜等。其基本原理是：将样品迅速冷冻后，由于膜结构的各部分之间的结合力不同，亲水区结合力强，而疏水区结合力弱，所以在外力作用下易从膜的疏水区劈裂，暴露出膜的疏水区的内外两个面。此技术用于研究膜的结构与功能。制备样品的基本过程是：（1）戊二醛固定。

（2）30％甘油冰冻保护。（3）用液氮或氟里昂迅速冷冻。（4）用冷冻蚀刻仪断裂样品，并喷涂铂金和碳膜复型。（5）用次氯酸钠腐蚀掉复型上的生物组织并彻底清洗。（6）将带有样品表面结构信息的复型捞在格网上，自然于燥后用透射电镜观察。