超薄切片技术

为了研究细胞组织的精细结构，甚至分子、原子的排列，需借助电子显微镜作为观察工具。电镜以电子束作光源，电子束的穿透能力是有限度的， 常规透射电镜工作电压为 75～100 千伏情况下，所观察样品厚度最多不能超过 0.1 微米，对一般生物样品是不能穿透的。加以生物组织的主要成分为水， 当样品放入电镜后，在高真空下会产生严重脱水而改变结构，而构成生物样品的元素多为 C、H、O、P、N 等，其反差很弱，难以观察。为此，必须制备样品使其能使电子穿透，并代表活体状态又加强反差，即制备厚度在 1000 埃以下的超薄切片，制备过程如下。

固定 固定的目的是获得正常生命状态下的细胞。超薄切片常用的固定液有四氧化锇（OsO4 ）（误称锇酸）和戊二醛。OsO4 为淡黄色晶体，水溶液为中性，为强氧化剂。对细胞质各种结构及其含物有较好的固定作用。配制2％OsO4 溶液时，用清洁棕色瓶，装入 25 毫升或 50 毫升蒸馏水，将装有 OsO4 的安瓿瓶洗净放置于此棕色瓶中摇荡，使安瓿打碎在瓶中，在 0～4℃保存备用。戊二醛为常用的初固定剂，其特点为穿透比较快，可弥补四氧化锇之不足，固定用 2.5～4％。

取材固定方法：组织离体后易自溶，会破坏细胞的精细结构。取材时将动物麻醉，暴露所需脏器，将前固定液戊二醛滴于欲取器官组织上，剪下一小块组织，放在滴有固定液的纸片上，迅速用刀片将其切成 0.5 毫米以下小块，用牙签将其装入有固定液的小瓶中，在 4℃冰箱中进行固定。以上各步争取在 1 分钟内完成。

前固定在 2.5～4％戊二醛中，0.5～2 小时。

浸洗用浸洗液洗 30 分钟，换两次（此步可保存过夜）。（可用 Hanks 液配制浸洗与固定液，方法简便）

后固定于 1％锇酸固定液中固定 2～4 小时，浸洗如上。

脱水 脱水的目的是用既能和水也能和包埋单体相混合的液体代替样品中的所有游离水。使用较广的脱水剂为乙醇和丙酮。以丙酮系列为例：50％、70％、90％中各 10～15 分钟。纯丙酮 2～3 次，每次 10～15 分钟。90％丙酮以前皆在冰箱内（0～4℃）进行，100％在室温进行。70％酒精或丙酮中可放置较长时间，其他浓度中组织如放置过久会引起膨胀或固缩，影响切片质量。

浸透、包埋、聚合 目的是使样品中的细微结构在切片过程中能得到良好的支持，切片能连续完整，样品脱水后包埋在一定的介质中。常用的包埋介质有：

环氧树脂：实验室常用国产环氧树脂 618，进口产品 Epon812。

硬化剂：一般选用琥珀酸酐和苯二酸酐。常用为十二烷基琥珀酸酐

（dodecenylsuccinic anhydride，DDSA）（软化），与甲基内次甲基邻苯二甲酸酐（methydnalicahydrido MNA）

交链剂或加速剂：通常用 2，4，6，-三（二甲氨基甲基）苯酚（2，4， 6，tri（di-methyaminomethyl）phenyl）DMP-30

实验室常用包埋剂配制

Epon812 13 毫升 环氧树脂 618 6.0 毫升

DDSA 8 毫升 十二碳烯基丁二酸酐

4.0 毫升

改良 Luft 法，上海一医电镜室配方

用丙酮与包埋剂 1∶1 混合液过渡，纯包埋剂浸透分两次进行，一次在瓶内，一次在 2 号药用胶囊或包埋小管内。第 1 次 0.5～4.0 小时，第二次 4 小时以上或过夜。纯包埋剂可在 30℃温箱内进行，包埋剂不致固化，又可加速浸透，包埋剂处于均匀混合状态。

选择好标本，用牙签放入胶囊或包埋管的底部中央位置上，并加上标本标号。

浸透包埋的标本在 60℃温箱中聚合 24～48 小时，软硬适度的包埋块可进行修块。

如用胶囊包埋要用温水溶去，如用包埋小管则用刀片将其切开，进行修块。