微生物的纯培养技术

纯培养（pure culture）是指在同一培养物或一管菌种中，所有的细胞或孢子都是生物分类中的同一个种。严格说，是在培养基上由一个细胞分裂、繁殖所产生的后代。

自然界的微生物均混杂存在，为获得某种微生物，需采取一系列措施将其从混杂菌群中分离为纯培养；由于周围环境、空气、用具、操作者体表均有大量微生物存在，为获得和保持纯培养，在分离、培养过程中，必需严格操作，以防止杂菌污染。纯培养技术包括灭菌、消毒技术和分离接种过程的无菌操作技术。

灭菌、消毒 培养基、器皿、接种工具的彻底灭菌，环境及某些材料的消毒，是防止杂菌污染，保证纯培养的关键步骤。常用方法如下。

干热灭菌通过加热使蛋白质变性或凝固，或直接烧死菌体。又分为： 1.烧灼灭菌：直接用火焰烧灼用具上的杂菌，如接种时在火焰上灼烧接

种工具、试管口、瓶口等，或焚烧废弃的带菌物品。

2.烘箱灭菌：玻璃器皿、接种用具、手术器械经包装后，放电热干燥箱中，升温至 160～170℃，1～2 小时，可彻底杀灭杂菌。灭菌后的物品保持干燥，带包装存放备用，不易污染。但应注意温度及时间均不可超过上述规定，否则包装纸被烤焦，不宜使用。

湿热灭菌直接煮沸或用饱和水蒸汽的高温进行灭菌或消毒。常用的方法有高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、巴斯德灭菌、煮沸消毒等。

高压蒸汽灭菌（autoclaving）：亦称饱和蒸汽灭菌。是医疗保健、发酵工业及微生物实验、科研中常用的灭菌方法。利用水的沸点随水蒸汽的压力增加而上升所产生的高温，达到灭菌的目的。常用的灭菌装置为高压灭菌锅，是用铝、铁等金属制成的可密闭容器，可承受一定压力（一般耐压为 5 公斤/厘米 ²），分为手提式、立式及卧式等。加热后锅底的水不断产生蒸汽，待冷空气排除后，使完全密闭，温度即可随蒸汽压力而上升。常用于培养基、水等灭菌，1.05 公斤/厘米 ²（15 磅/英寸 ²），即温度 121℃，15～20 分钟即可。使用高压锅在升压前必须充分排除冷空气，才能保证压力上升与温度上升相一致；到达所需压力（温度）必须保持恒温，到达恒温时间后，切断电源，待压力缓缓下降至零点，方可排汽、开盖。
间歇灭菌：在没有高压灭菌锅时，采用常压间歇蒸煮的方法灭菌。即

将待灭菌的培养基等放在蒸锅内，经 100℃热蒸汽蒸 3 次，每次 30～60 分钟。第一、二次蒸后放 25～30℃恒温过夜，以使未杀死的芽孢萌发，待第三次蒸后，即可达到灭菌的目的。但此法较麻烦，且会使培养基营养成分破坏，在设备允许的情况下，不宜采用。

巴斯德灭菌：由巴斯德首创。即在 60℃条件下保持 30 分钟，可杀死致病微生物而保持营养成分不被破坏。因仅杀死致病微生物，故又称巴氏消毒法。常用于牛乳、啤酒等食品的消毒。
煮沸消毒：把物品直接放在清水中煮沸，5 分钟以上可杀死全部营养细胞，15～20 分钟或在水中加入 1％碳酸钠，效果更佳。用于带菌物品、器皿的初步清洗。

接种室、接种箱的灭菌和消毒

清洗桌面，照射 20～30 分钟即可保持无菌状态。使用紫外灯灭菌，一定要在工作开始前关闭，以免损伤皮肤及粘膜。

化学药剂消毒：接种室及接种箱使用前后均需用 2～3％来苏水或 5％

石炭酸擦洗及喷洒，以增强紫外线的杀菌效果。
硫磺或甲醛熏蒸：较大的接种空间，可用硫磺熏蒸。用量为每平方米空间

3～4 克。熏蒸前先将地面及墙面喷洒少量水，将硫磺放金属器皿中再加热。甲醛熏蒸需用高锰酸钾做氧化剂。通常每立方米空间用 6～8 毫升 40％甲醛（市售福尔马林），4～5 克高锰酸钾。室内打扫擦净后，将高锰酸钾放在容器中（玻璃、陶瓷器皿），然后倒入甲醛（不必加热）。以上熏蒸均刺激呼吸道、眼等处、操作者应迅速离开，过夜后方能入室工作。

无菌操作技术（aseptic technigue）培养基、器皿、用具等经灭菌后，在无菌环境中（接种室、接种箱）将含菌材料接种到培养基上的操作过程，即无菌接种操作。

接种是微生物学实验研究及生产的关键，严格的无菌接种操作，才能保证上述各项工作顺利进行，否则将导致杂菌污染，工作失败甚至纯种丢失。

试管斜面接种操作示意接种环的火焰灭菌（1）左手夹住试管（2）灼烧接种环（3）拔出棉塞，夹在小指、无名指上，管口过火（4）取菌、接种，接种后在火焰上方迅速塞好棉塞

无菌操作技术的掌握需经严格训练，具体方法需在实践中学习，以下仅说明操作要点。

进行无菌检查：培养基、器皿等使用前应抽样检查。将无菌培养基抽样置 37℃培养 2 天，观察有无杂菌生长。在培养皿中倒入熔化的固体培养基，冷凝后放同样条件下培养及观察。

在接种室（箱）中定期用固体培养基倒平板，打开皿盖 5 分钟，加盖后放温箱中培养。在灭菌前后各做 2～3 个平板，观察接种室（箱）污染及灭菌情况，做到心中有数。

操作过程建立无菌概念，注意防止杂菌污染：已灭菌的培养基、器皿使用中应注意保持无菌，不可随意打开皿盖；瓶（管）口的棉塞及移液管等，使用前均不可暴露在空气中甚至弃置桌面。取放试管培养基时，切勿平放或倒置，以免棉塞被沾湿，导致污染。在气流小的情况下，空气中的杂菌也可随灰尘落下，故接种时管口、瓶口、培养皿等均不可垂直暴露，应充分利用酒精灯火焰周围的无菌区，操作应迅速、准确。
注意保持无菌环境：接种中凡使用过的带菌用具、器皿，如移液管、试管、菌液等，不可随手弃置桌上，应浸泡在 5％来苏水中或置放在固定的容器中。接种环等接种工具，在每管接种前后均应充分灼烧灭菌，否则将直接导致杂菌污染。