影响 PCR 方法的一些因素及改进措施

在 PCR 操作中，确定 2 个寡聚核苷酸引物是扩增目的 DNA 片段的关键。要扩增某一 DNA 片段，必须首先知道这一段 DNA 相邻两端的核苷酸序列，才能用化学方法合成出 PCR 引物。引物的长度不能少于 16 个核苷酸，以保证引物与模板的特异性吸附。但也不必合成太长的引物，以免造成浪费。

在 PCR 方法早期被利用时，一般选用 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段来合成新生 DNA，但是 Klenow 在 DNA 高温解链时会变性失活，因此，每一个循环都要补充新的酶，这就限制了扩增 DNA 的长度。1988 年，Erlich 等人报道了耐热的 Taq DNA 聚合酶的分离纯化，它可以在高温下保持活性，适合于 PCR 操作的使用，这也使 PCR 技术得到简化并推入应用阶段； 而且，Taq 酶可以在高温下进行聚合反应，也提高了引物与模板之间的退火结合的特异性。但是，Taq 酶的酶量仍然是制约反应程度的因素，因此， 这一扩增不可能在一个体系内不断进行下去，一般只能进行 30 个左右的循环。要继续进行扩增，必须要对第一次扩增的产物进行稀释，作为后一轮的模板，开始新的 PCR 反应。

由于 Taq DNA 聚合酶缺乏对错误的校正功能，在 PCR 过程中会有一定频率的错误合成。对 30 轮循环的 PCR 反应来说，可导致 0.25％的总错误率。因此，如果需要扩增某一 DNA 片段，需对两个或更多的克隆进行DNA 的序列分析，以确定正确的扩增 DNA 序列。