（四）基因工程技术的重大突破

基因工程技术的重大突破——多聚酶链式反应（PCR）技术和寡聚核苷酸定点诱变技术的发明。

多聚酶链式反应（PCR）技术

多聚酶链式反应（PCR），又称“基因放大”方法，是由美国的生物化学家 K·B·穆利斯（Kary B Mullis，1945—）发明的。其基本原理如下：首先，根据待扩增 DNA 片断两端的核苷酸序列，用化学合成的方法，合成两个不同的寡聚核苷酸引物，它们与 DNA 的两条链互补配对。将过量的化学合成引物与 4 种脱氧核糖核酸（dNTP）、DNA 聚合酶以及含有待扩增片断的 DNA 分子混合，经过高温变性（使 DNA 双链解开）、低温退火（使引物与模板附着）和中温延伸（合成新的 DNA 片断）3 个阶段的多次循环。由于新合成的DNA 链也能够作为模板，可以使模板 DNA 的信息以几何级数扩增。一般经过30 次～35 次扩增循环，每一循环只需 3 分钟～10 分钟，可以得到足够数量的目的 DNA 片断，使基因放大了数万倍。据称，穆利斯在 1985 年一次深夜驾车时，大脑中猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。同时他也意识到这一设想如果可行，他将名扬天下。穆利斯因发明 PCR 方法成名之后，就开始写他的第一本书，书中详细披露多聚酶链式反应的研究过程以及附后的法律争端。

PCR 的方法灵敏度高，扩增倍数大，对一段 2000 个碱基对长的 DNA，可以从原来的 1×10-12g 扩增到（0.5-1.0）×10-6g。在结合其他生物化学方法时，可以测出占总 DNA 的 1/1013 比例的单拷贝序列。

寡聚核苷酸定点诱变技术

寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家 M·史密斯（Michael Smith，1932—）发明的。其基本原理如下：应用寡聚核苷酸进行 DNA 的定点诱变时，首先要把含有待突变的 DNA 片断段克隆到 MI3 噬菌体载体中，MI3 噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链 DNA 的噬菌体。而存留在菌体内的则是双链状态的复制型 MI3。受 MI3 噬菌体感染的细菌长生速度减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。

将目的 DNA 插入到复制型 MI3 的多克隆位点上，去转染细菌，提取单链DNA 作为突变的模板。根据需要设计并合成带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使与带有目的 DNA 的单链 MI3 模板杂交，然后加入 DNA 聚合酶和 4 种脱氧核糖核苷酸，使杂交上的突变引物延伸，并用 DNA 连接酶使新合成的DNA 成环状，再去转染细菌。可用 DNA 序列分析的方法从所得到的噬菌体中筛选出带有突变 DNA 序列的突变体。在制备出含有突变体的复制型 DNA 后，可以用突变的 DNA 片段置换未突变的 DNA 相应的区段，从而得到完整的 DNA 突变体。

M·史密斯于 1932 年出生于英国，毕业于英国的曼彻斯特大学。1956 年移居加拿大，曾任加拿大温哥华大不列颠哥伦比亚大学生物技术实验室主任。在英国剑桥大学作客座教授期间，他在一次工间休息喝咖啡时，与同事

讨论中突然想起一个主意：如果合成一个略加改造的寡聚核苷酸，并作为引物与一个 DNA 分子结合，再使其进入一个合适的宿主内复制，从理论上来讲，应该能引起 DNA 分子的突变，并产生一个改变了的蛋白质。到了 1978 年，M·史

密斯与他的同事就这一想法进行了试验，发明了寡聚核苷酸定点诱变技术。这就有可能在体外对已知的 DNA 片段内的核苷酸进行置换或增删式的突变，改变了已往对遗传物质 DNA 进行诱变时的盲目性和随机性，可根据实验者的设计而有目的地得突变体。

利用寡聚核苷酸定点诱变技术，可以人为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的相互作用。目前，利用寡聚核苷酸定点诱变技术来进行酶及其他蛋白质的稳定性、专一性的活性研究，已经有很多实例。例如，对胰蛋白酶的功能基团的研究、高效溶栓蛋白类药物的研制、白细胞介素-2 结构与功能的分析等等，都必须利用这一方法。

随着 PCR 技术的广泛应用，使得在某些情况下的寡聚核苷酸定点诱变能够变得更加简便有效。同时，由于寡聚核苷酸定点诱变技术的发展，使得 PCR 技术有了新的用途。由此可见，PCR 和寡聚核苷酸定点诱变这两项技术，已经成为基因工程操作中先进而又基本的方法和工具，在未来的分子生物学研究中将大显身手。由于他们在遗传工程研究领域中各自取得突破性成就，共同分享 1993 年诺贝尔化学奖。