（一）比色法

分光光度法的前身是比色法。比色分析法有着很长的历史。1830 年左右，四氨络铜离子的深蓝色就被用于铜的测定。奈斯勒的氨测定法起源于1852 年，大约在同一年，硫氰酸盐被用来分析铁。1869 年，舍恩报道说钛盐与过氧化氢反应会产生黄色，1882 年，韦勒（Weller）将此黄色反应改进成一种钛的比色法。钒也能与过氧化物发生类似的反应，生成一种橙色络合物。1912 年，梅勒一方面利用 1908 年芬顿发现的一个反应（二羟基马来酸与钛反应呈橙黄色，与钒反应无此色），另一方面利用与过氧化物的反应，得出了一种钛和钒这两种元素的比色测定法。

吸收光度分析法提供了非化学计量法的一个很好例子。有色化合物的光吸收强弱随着所用辐射波长的大小而变化。因此早期的比色法主要凭经验将未知物与浓度近似相等的标准溶液进行对比。比如象奈斯勒在氨测定法中所作的比较。比色剂，如杜波斯克比色计，是通过改变透光溶液的厚度和利用比尔定律，来对未知物的颜色与标准液的浓度进行对比的，这种仪器并不适用于所有的有色物质，它充其量也不过经验程度很高罢了。

1729 年，P·布古厄（Bouguer）观察到入射光被介质吸收的多少与介质的厚度成正比。这后来又被 J·H·兰贝特（Lambert，1728—1777）所发现，他对单色光吸收所作的论述得到了下列关系式：

dI = a·dx I

上式中 I 是通过厚度为 x 的介质的光密度，a 是吸收系数。利用边界条件 x=0 时，I=I0，积分得到：

I=I0e-ax

1852 年，A·比尔（Beer）证实，许多溶液的吸收系数 a 是与溶质的浓度 C 成正比的。尽管比尔本人没有建立那个指数吸收定律公式，但下列关系式

I=I0e-acx

仍被叫做比尔定律，式中浓度和厚度是作为对称变数出现的。这个名称似乎是在 1889 年就开始使用了。

1940 年以前，比色法一直是最直观的分析法，往往是以高度经验为根据的——实际上依靠了奈斯勒管、杜波斯克比色计和拉维邦色调计。色调计利用可叠加有色玻璃盘作为颜色比较的载片。某些测定甚至是将颜色与彩纸和有色玻璃作比较来进行的。T·W·理查兹在有关卤化银的测定方面，发明了一种散射浊度计，用通过微浊溶液来测量光散射。

1940 年初左右，分光光度计开始广泛使用，几种高质量、应用简便的工业仪器使比色法更加普及，最著名的仪器，如蔡斯—普尔费利希、希尔格、斯佩克尔、贝克曼和科尔曼分光光度计，采用滤波器、棱镜和光栅，使光的波长限制在一个很窄的范围内。光吸收一般是用光电管测量的。

典型的比色试剂是二苯基硫卡巴腙（diphenyl-thiocarbazone）通常叫做双硫腙 dithizone，是艾米尔·费歇尔在 1882 年发现的，他观察到双硫腙很容易和金属离子形成有色化合物，但他没有继续这项研究。1926 年，海尔穆特·费歇尔研究了这个化合物，并报道了把它用于分析的可能性，这种可能性在 30 年代得到了最充分的利用。这种试剂与大量阳离子所形成的有色螯合物极易溶解于氯仿那样的有机溶剂中。于是，这种络合物就可从大量的水溶液中萃取到少量的溶剂中，从而使这种方法对痕量物质也非常灵敏。

比色法借助仪器可用于波长短到 2000Å 的紫外区。向紫外区的进一步扩展是不可能的。因为容器、棱镜及空气本身也会吸收光。记录方法（起初主要是照相记录），随着实用光电管的发展得到了明显的改进。紫外分光光度法在测定芳香化合物，如苯酚、蒽和苯乙烯方面特别有价值。

紫外吸收在研究有机化合物的结构时也很有用，它同束缚松散的电子缔合，如出现在双键中的电子。乙烯、乙炔、羰基化合物和氰化物中的不饱和键吸收 2000Å 以下的光，因此处于紫外分光光度计可测范围之外。不饱和键周围有取代基时，会使光的吸收向长波方向移动，但仍远离实际可测的范围。偶氮基、硝基、亚硝酸盐、硝酸盐和亚硝基的吸收光范围在 2500～3000Å 之间。不饱和键发生共轭现象会使吸收增强。引起光向长波方向移动。芳香环具有一个特征吸收本领，可用于鉴定。