（四）分配色层法

分配色层法是 A·J·P·马丁（生于 1910 年）和 R·L·米林顿·辛格在1941 年采用的。1938 年，辛格在研究乙酰氨基酸时观察到，这些氨基酸在氯仿和水之间的分配系数明显不同。马丁曾在那以前研制出一种用于维生素纯化的逆流萃取器。他们进行合作尝试在两种逆向流动的溶剂间分配氨基酸以便分离它们，但这没有成功。后来他们发现，如果使水吸附在硅胶上保持水相不动，只许氯仿相流动的话，分配过程就可顺利进行。他们还发现，如果使用甲基橙那样的不溶于氯仿的指示剂，就有可能检测到乙酰氨基酸在柱上的层带。

这项技术不久就被伊舍伍德用来分离富马酸、琥珀酸、草酸、苹果酸、柠檬酸和酒石酸。在分离过程中使用了氯仿—丁醇作为流动相，稀硫酸作为固定相。列维和他的同事们则利用这一技术来分离青霉素。美国食物药品局的拉姆赛和帕特逊将分配色层法用于分离六氯环己烷和 C5—C10 脂肪酸。他们开辟了非水体系分配色层法，一方面在硅胶和正己烷上使用硝基甲烷进行分离，另一方面在硅胶和三甲基戊烷上使用甲醇进行分离。

1943 年，A·H·戈登、马丁和辛格在硅胶上进行某些氨基酸的分离时遇到了困难。他们转而研究其它像淀粉和纤维素那样一些吸水物质。他们使用外围被水蒸气饱和了的滤纸，分离了各种氨基酸混合物，并通过用茚满三酮喷射和加热检测了这些氨基酸的位置。

纸条层析法从此迅速发展起来。1944 年，R·康斯登与戈登和马丁一起提出了一种二维技术，用来实现难结合物的分离。依此法先在一张方形滤纸的一个角上点滴试验物质，如蛋白质水解产物，然后用适当的溶剂展开。这样各种组分就沿着滤纸的边缘扩散，待干后，将滤纸转九十度弯。改用第二种溶剂展开。结果，第一种溶剂不能分离的组分经第二种溶剂就被分开了。康斯登及其同事先用苯酚和水，接着再用可力丁和水，对二十多种氨基酸进行展开。从而确定了他们的位置。

帕特里奇采用纸条层析法鉴定还原糖，并用硝酸银的氨溶液来显露色带。古达尔和列维利用纸上层析法分离青霉素，通过把滤纸放在接种有枯草杆菌（B.Subtilis）的琼脂培养基上，确定了每种活性化合物的位置。这种方法借助观察青霉素点邻近的抑制生长程度而改进成一种定量试验。纸上层析法也有了其它各种用途，包括无机阴、阳离子混合物的分析，但它主要用于定性分析工作中。

马丁和辛格因在 1941 年发明了分配色层法特别是纸上色层分析法而共

享了 1952 年诺贝尔化学奖。这种方法在生物化学和分子生物学革命中将成为一种基本的分析工具。用这种方法辛格弄清了简单的蛋白质短杆菌肽

（Gramicidins）的结构，找出了几种氨基酸在这种分子中的次序。很快就证明，这项工作对于 F·桑格阐明在胰岛素分子中氨基酸的排列次序有巨大作用。但是马丁本人对他们贡献的评价却不那么高，他指出：“整个思想都很简单，如果人们的思想都能指引到这一思路上的话，大概早在一个世纪以前这个方法就盛行了。”