第一节 植物组织培养

组织培养是指在离体条件下，把植物的一小部分组织或器官，如一个茎尖、一小块叶或一小段茎，接种于培养基上，使它们重新形成完整植株的一种方法。这种方法的依据是植物 7 体的任何一个细胞都具有“全能性”。所谓细胞的全能性，是指植物体上任何一个器官中已分化成熟的细胞，都具有生成完整植物体的遗传本领，把它们在离体条件下进行培养，就能生成一个完整的植株。

组织培养在培育农作物新品种、快速繁育优良植株系、获得无病毒植物等方面，具有重要作用，已开始成为一项全新的生产技术。

一、组织培养所需的用具用品

接种箱（图 1—1）、培养箱、手提式高压灭菌锅、冰箱、粗天平、分析天平（精确度为 0.1 毫克）、三角瓶（25～50 毫升）或试管（直径 16 毫米）、烧杯（250、500、1000 毫升）、移液管（0.2、0.5、1.0 毫升）、量筒（50、100、500 毫升）、漏斗（直径 4～5 厘米）、培养皿（直径 8～10 厘米）、细口瓶、镊子、剪子、手术刀、酒精灯、配制培养基所需的各种化学试剂、灭菌剂等。8 二、组织培养的方法和步骤

（一）配制培养

基培养基是组织培养中植物材料赖以生存和生长的基地。进行组织培 养，首先必须配制培养基。培养基的配制包括确定配方、制备母液、具体操作和灭菌保存等四个步骤。

1. 确定配方。培养基的配方很多。少年儿童进行组织培养，所用植物材料多为一般种类，可采用 MS 培养基。

MS 培养基的配方如下（单位：毫克/升）

铁盐：5.57 克的硫酸亚铁（FeSO4·7H20）和 7.45 克乙二胺四乙酸二钠

（Na2-EDTA）溶于 1 升水中的溶液

5 毫升/升

硫酸锰（MnSO4·4H2O） 22.3

硫酸锌（ZnSO4·7H2O） 8.6

硼酸（H3BO3） 6.2

碘化钾（KI） 0.83

钼酸钠（NaMoO4·2H2O） 0.25

硫酸铜（CuSO4·5H2O） 0.025

氯化钴（CoCl2·6H2O） 0.025

甘氨酸 2

盐酸硫胺素 0.4

盐酸吡哆素 0.5

菸酸 0.5

肌—肌醇 100

蔗糖 30000

琼脂 10000

pH 5.8

MS 培养基配方中不包括激素。培养基中激秦加入的种类和数量，在组织培养的不同阶段，常不相同。

1. 制备母液。配制培养基，虽然可按配方所列成分和用量直接制成，但这样做，每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，十分费力。正确的做法是把培养基中的各种成分，按原量 10 倍、100 倍或 1000 倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的 1/10、1/100 或 1/1000，加以稀释，即成培养液。现将培养基中各类物质制备母液的方法说明如下：

1. 大量元素母液大量元素母液是指硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化钙等用量较大的几种化合物的母液。制备时，以其 10 倍的用量， 分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到 1 升，即成大量元素母液。

2. 微量元素母液微量元素母液是指硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴等用量微小的化合物的母液。因为用量少，为称量方便和精确起见，应配成 100 倍或 101000 倍的母液。配制时，把每种化合物

的用量加大 100 倍或 1000 倍，逐次溶解并混在一起，即成微量元素母液。

1. 铁盐母液单独配制，可按 MS 配方中的规定进行配制。

2. 有机物质母液主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是分别称量、分别配成所需要的浓度（0.1～10 毫克/毫升），是只含一种成分的母液。

3. 植物激素母液常用的植物激素有生长素、细胞分裂素和赤霉素三种。植物激素的使用浓度很低，一般为 0.01～10 毫克/升。可按用量的 100 倍或 1000 倍配制母液，制备时要单个称量，分别配成。

以上各种母液，都要放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求随称随用。

1. 配制培养基的具体操作方法。

1. 根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需要的用

量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。

1. 称好的琼脂加蒸馏水 300～400

   毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。

2. 将（1）中所取的各种物质（包括蔗糖），加入煮好的琼脂中，再加水至 1000

   毫升，搅拌均匀，配成培养基。

3. 用 1N

   的氢氧化钠或盐酸，滴入（3）中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用 pH 试纸测 pH 值，直到将培养基的 pH 值调到 5.8。

4. 把配好的培养基用漏斗分装到锥形瓶（或试管）中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容器容量的

   1/4 或 1/5。

1. 培养基的灭菌与保存。为防止培养基被菌类污染，培养基须放入高压灭菌锅中灭菌 20 分钟。灭菌后的培养基放在 10℃下保存备用。

（二）选择培养材料

1. 材料选择的依据。虽然所有的植物细胞都具有全能性，但同一植株上不同部位的组织器官，其全能性的表现能力各有不同。一般来说，处于生长状态比较幼嫩的组织器官，或扦插容易成活的组织器官，全能性的表现能力较强，容易培养。所以应该选择这样的组织器官作为培养材料，如幼根、幼茎、幼叶、幼花、幼果和茎尖等。

2. 材料的大小。培养材料的大小，没有严格限制，但太小不易产生愈伤组织，太大又会使培养瓶难以容纳，一般应在 0.5 厘米左右。

3. 材料的灭菌。材料选择好以后，接种前应进行表面灭菌。常用的灭菌剂有安替福民（次氯酸钠溶液）和氯化汞。前者的浓度应为 6％～10％，后者浓度为 0.1％～0.5％。

（三）接种

接种是指将灭过菌的材料，在无菌的情况下切成小块放入培养基的过程。接种在接种箱内进行，程序如下：

1. 在接种箱中摆好接种时所需要的酒精灯、70％的酒精棉球、镊子、手术刀、火柴、培养基等。

2. 接种箱内用紫外线灯灭菌 20 分钟。

3. 放入已灭菌的接种材料（用培养皿盛取），同时，操作人员用酒精棉球擦手，并对接种工具用酒精灯火焰烧灼。

4. 用手术刀把材料切割成若干片段，迅速接种入培养基中。接种时，锥形瓶口（或试管口）应斜向火焰，在酒精灯火焰附近操作。

5. 材料接种后，将锥形瓶口（或试管口）在酒精灯火焰上转动烧一遍， 盖好瓶盖，注明材料名称及接种日期。

（四）培养

被接种在培养基上的离体培养材料的片段，叫外植体。外植体连同培养基应放入培养箱内进行培养。培养箱可用钢材作框，镶以玻璃，体积可与接种箱相同。

1. 培养条件。外植体在生长分化中要求较高的温度和较强的光照。

1. 温度培养箱的温度应保持在 25℃～28℃。为了保持温度恒定，可采用电炉连接继电器和一根可控温度计的方法来调节。

2. 光照培养箱中的光照，可以安装日光灯来解决。光照强度应为2000～3000 勒克斯，光照时间每天约为 10～12 小时。

1. 在培养过程中外植体的分化。在培养过程中，外植体逐渐发生分化。

由于外植体所属植物种类和器官组织类型不同，又由于培养基中植物激素等因素的影响，使外植体沿着不同途径进行分化。其分化途径一般有以下三种：

1. 侧芽增殖把茎尖或侧芽作为培养材料培养，在培养基中加入细胞分裂素（有时也同时加入少量生长素），外植体就会不断分化生长，形成侧芽芽丛。如果反复对芽丛切割和转移到新的培养基中继代培养，就可在短期内得到大量的侧芽。在这个途径中，最常用的细胞分裂素是 6—苄基嘌呤，其浓度为 0.5～2 毫克/升。如果同时加入生长素，则常用萘乙酸（0.05～0.5 毫克/升）。为了促进侧芽生长，也常加入赤霉酸（0.5～2 毫克/升）。目前已有近百种植物，可以通过这种途径形成大量侧芽，如苹果、葡萄、月季等。

2. 诱导不定芽的形成这种途径有两种不同表现：一种是由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化成不定芽，如菊花花瓣和叶片的培养；另一种是直接从外植体产生芽原基，再进而发育成不定芽，如竹节秋海棠的叶片培养。不定芽的形成，与培养基中激素的配比与用量有密切关系，培养时， 要参考资料或通过实验才能决定。

3. 胚状体的形成在组织培养中，由外植体或愈伤组织产生的类似胚的一种结构，叫胚状体。胚状体具有胚芽和胚根。在诱导胚状体形成时，一般使用胚、分生组织或生殖器官作为外植体。其培养基中，大多加入 2，4—D。目前已有 150 多种植物可以产生胚状体，如胡萝卜、芹菜等。

（五）试管苗的生根

在锥形瓶或试管内培养基中的外植体，通过培养与分化，形成幼苗。这种幼苗叫试管苗。经“侧芽增殖”和“诱导不定芽形成”两种途径所生长成的试管苗，一般只长苗而不生根。因此，要更换一次培养基诱导生根。诱导生根的培养基中，通常加入萘乙酸，浓度为 0.1～10 毫升/升。

在更换培养基后，要把盛装试管苗的瓶口打开，上盖 1～2 层纱布，便于通气。并适当加强光照以增强试管苗的自养能力。大约经过 10 天左右，会生出根来。

（六）移栽

当试管苗的根原基形成突起或形成几毫米长的短根时，把苗从锥形瓶或试管中取出，洗去所附着的培养基，栽入含有营养液的蛭石、炉渣或草炭等人工基质中继续培养。移栽后，应保持高湿度，避免阳光直射和过大的温度波动。经过一段逐步锻炼的过程，再定植到土壤中。至此，组织培养工作全部完成。整个过程约需 2～3 个月。

三、注意事项

（一）做好灭菌工作

灭菌是组织培养能否成功的关键因素。凡用具用品、培养基，植物材料以及移栽用的人工基质等，都需进行灭菌，以避免发生细菌和真菌污染。

（二）注意使用植物激素的种类与用量

在外植体和试管苗的生长分化过程中，必须使用植物激素进行调节。不同种类的植物激素或同一激素的不同浓度，对外植体和试管苗的生长分化具有不同的调节作用。因此，在使用植物激素时，种类和用量必须严格遵照培养基配方的规定，不可随便变更。

（三）做好记录

组织培养的记录内容主要有培养基的配制、植物材料的选择、接种时间、外植体生长分化情况、试管苗生根时间、移栽时间、培养过程中发生的问题

及处理方法等。