第三节 细菌培养和观察

细菌属于微生物。在各类微生物中，细菌的分布最广、数量最大、与人类关系最密切。全世界已知细菌共有 2000 种，它们的身体都由一个细胞组成，平均体长 2～3 微米、宽 0.5 微米，十分微小。细菌有球状、杆状和螺旋状三种基本形态，分别被称为球菌、杆菌、螺旋菌。

细菌一般进行分裂繁殖，分裂结果形成两个大小相同的子细胞。在最适宜条件下，20～30 分钟就能分裂一次，并可继续分裂若干次。细菌在固体培养基上分裂繁殖时，许多细胞堆集在一起，形成肉眼可见的群体，称为菌落。不同种类细菌的菌落形态互不相同。

有些种类的细菌生长到某个阶段，菌体失去水分浓缩成芽孢。芽孢的壁很厚，渗透性很弱，含水少，能抵抗不良环境，可生存十几年，遇到适宜的环境条件，再萌发成为一个新菌体。

培养和观察细菌，是一项比较复杂的科技活动，它需要准备各种用具用品、配制培养基、灭菌、接种等工作，然后才能进行细菌的培养和观察。

一、本项活动的用具用品

（一）仪器设备

接种箱（规格见本章第一节）、恒温箱、冰箱、天平、高压蒸汽灭菌锅、显微镜（附油镜头）、接种针等。

（二）玻璃器皿

培养皿、试管、锥形瓶、量筒、量杯、移液管、烧杯、漏斗等。

（三）培养基原料

牛肉膏（或鲜牛肉）、蛋白胨、食盐、琼脂等。

（四）其他用品

酒精灯、镊子、滤纸、纱布、普通棉花、载玻片、结晶紫染色液（或番红染色液）、pH 试纸等。

二、本项活动开展的步骤方法

（一）配制培养基

培养基是微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，不同类群的微生物要求不同成分的培养基。

1.常用细菌培养基配方。

1. 营养肉汤培养基

牛肉膏 3 克

蛋白胨 1 克

食盐 5 克

水 1000 毫升

pH 7.1～7.2

1. 营养琼脂培养基在上述营养肉汤培养基的配方中，增添琼脂 20 克，

   即为营养琼脂培养基。

2. 肉汁蛋白胨液体培养基

牛肉 500 克

蛋白胨 10 克

食盐 5 克

水 1000 毫升

pH 7.1～7.2

如在本配方中加入 20 克琼脂，即成肉汁蛋白胨固体培养基。2.培养基配制过程。

1. 配制溶液从上述几种培养基配方中任选一种，按 照配方向容器内加入所需水量的一部分，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后补足所需水分。对牛肉膏和蛋白胨，需加热溶解；对新鲜牛肉，需去掉脂肪、筋腱，绞碎，加水浸泡，在 15℃下放置 12 小时或 50℃下放置半小时，用纱布过滤后， 与蛋白胨一起加热。待全部溶解后补足因加热所蒸发的水分。

配制固体培养基时，先把上述已配好的液体培养基煮沸，再加入称好的琼脂，继续加热至完全融化。

1. 调节 pH 值用 pH 试纸测试培养基的 pH 值，如不符合需要，可用 10

％盐酸或氢氧化钠进行调节。

1. 过滤 用纱布或滤纸趁热对培养基进行过滤。

2. 分装 如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中。一只 15

×150 毫米的试管，装入的培养基约 3～4 毫升；如果要制作平板培养基或液体培养基，就把培养基分装于锥形瓶内，每只锥形瓶只装入其容积一半的培养基。分装时，不要让培养基粘附在管口、瓶口处，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。

1. 加棉塞培养基分装后，要用棉塞堵住管口或瓶口。棉塞应采用普通、新鲜、干燥的棉花，不要用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水而使棉塞无法使用。棉塞的制作方法是将棉花铺展成适当厚度，揪取掌心大小一块，铺在左手的拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中间，同时左手食指与拇指稍稍紧握，就会形成长棒状的棉塞。棉塞做好后，应迅速塞入管口或瓶口中，

塞入的深度为棉塞的 2/3。棉塞要松紧适度，既要紧贴内壁而不留缝隙，以防空气中微生物侵入，又要不过紧，使之能起到过滤空气的作用。理想的松紧程度以手提棉塞时瓶、管不落为合适。

塞好棉塞的锥形瓶和试管，应盖以厚纸，用绳捆好，准备灭菌。

（二）灭菌

灭菌是细菌培养能否成功的关键一步，培养基、各种培养用具用品、操作人员的双手都应进行灭菌。

1. 培养基和玻璃器皿的灭菌。已分装好的培养基和已清洗干净的玻璃器皿，应进行高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌的容器是高压蒸汽灭菌锅。灭菌时， 锅内注水，利用煤气、电等热源，使锅内蒸汽压力上升到 2 个大气压、蒸汽温度上升到 121.6℃。在此压力和温度下，经过 15～30 分钟，就能把培养基内和玻璃器皿上的所有微生物包括芽孢全部杀死。

使用高压蒸汽灭菌锅，必须严格按照操作规程进行操作，以免发生意外事故。少年儿童培养细菌时，如采用高压蒸汽灭菌锅灭菌，必须由教师带领进行，而且教师必须始终留在现场。如果没有高压蒸汽灭菌锅，可用家用高压锅代替。但家用高压锅没有压力表和温度计装置，无法准确掌握灭菌效果。因此，使用时应先进行灭菌时间的试验。方法是将需灭菌的物品放入锅内， 加热出汽后，盖好汽阀，继续加热 30～40 分钟，冷却后取出，把其中的培养基放置一天，观察是否有杂菌生长，如有，则再延长加热时间，直至不再出现杂菌污染为止。使用家用高压锅灭菌，同样须由教师自始至终在现场带领学生操作。

培养基和玻璃器皿的灭菌，也可以用普通的锅进行间歇灭菌。

1. 接种箱的灭菌。接种箱是对菌种进行接种的场所，必须保持无菌坏境。接种箱内应安装紫外线灯，在使用接种箱接种前，进行紫外线灭菌。灭菌时间一般为 10～15 分钟。为了检验紫外线灭菌效果，可以在接种箱内放置一份已灭菌的平板培养基，把盛放平板培养基的培养皿盖打开 5～10 分钟，然后放入温箱中培养，如有杂菌丛生，则需延长照射时间，如只有一两个菌落， 则可认为灭菌效果良好。

2. 其他物品灭菌。接种时所用的酒精灯、火柴、镊子、移液管、烧杯等物品，在擦洗干净后，放入接种箱，与接种箱一起进行紫外线灭菌。

3. 固体培养基灭菌后的进一步制作。固体培养基灭菌后，通常要进一步制作成斜面培养基和平板培养基。这种制作须趁培养基灭菌后尚未凝固时抓紧时间进行。

1. 制作斜面培养基在实验台上放一支厚约 1 厘米的长木条，将刚刚灭过菌含有培养基的试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。

2. 制作平板培养基将刚刚灭过菌、盛有培养基的锥形瓶和空培养皿放在实验台上，在酒精灯的火焰旁拔下锥形瓶棉塞，随即打开培养皿盖，迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入 10 毫升，以铺满皿底为度。然后放置

15 分钟，待培养基凝固后，再 5 个培养皿一叠，倒置于温箱中。24 小时后检查，如培养基上未长杂菌，即可用来培养细菌。

（三）接种

开展细菌培养观察所需要的菌种，可从科研部门、生产单位得到。菌种

得到后，应进行接种。接种方法很多，少年儿童接种细菌，可以采用以下两种方法：

1. 从一个斜面培养基接种到另一个斜面培养基。这种方法称为斜面接种法。主要用于保存菌种，传宗接代。其具体操作方法如下：

酒精灯点燃，左手拿住装有菌种和斜面培养基的两只试管，并将中指插入两试管之间，试管的位置要平行，管口齐平。右手持接种针，将针头和可能进入试管的针柄部分在火焰上烧红灭菌。

将两试管的管口靠近火焰，用右手小指与掌间拔掉两只试管上的棉塞， 迅速将试管口在火焰上烧灼约 3 秒钟，进行管口灭菌。接着将接种针伸入菌种试管内，先将针头接触培养基上无菌种的部位，使其冷却，然后轻轻取出少许菌体。

在火焰旁迅速将带有菌体的接种针伸进另一试管，在培养基上轻轻划 线，对菌体进行接种。划线应从试管底部开始，划较密的平行线，一直划到顶部。

接种完毕，烧灼试管口，在火焰旁塞好棉塞。

1. 从斜面培养基接种到平板培养基。这种方法主要用于观察菌落和菌体的形态。操作方法如下：

盛有固体培养基的培养皿底部朝上，用一只手的拇指和无名指将皿底固定成倾斜状态，在火焰旁稍微打开。同时，用同一只手的中指和食指夹住菌种试管，在火焰旁把试管棉塞取下，试管口在火焰上烧灼 3 秒钟。

将烧过的接种针伸入试管，取出菌种，迅速送入培养皿内，在平板培养基上作多次平行划线，进行接种。

接种后，将培养皿盖好，其底部仍然朝上。

（四）培养

接种后的斜面培养基和平板培养基，应放入温箱中进行培养。温箱温度应保持 28～30℃，每天进行检查，约经 5～7 天，被接种的培养基上就会长出菌落。如果长出的菌落确系被接菌种，又无杂菌污染，说明接种已经成功。

经过培养，平面培养基上充分生长的菌种，可用于菌落和菌体观察；斜面培养基上充分生长的菌种，可放在冰箱内 4℃温度下保存，并每隔一个月进行一次接种。

（五）观察

1. 菌落观察。观察平板培养基上的细菌菌落，观察内容有大小、形状、表面、质地和颜色等方面。其中，形状指圆形或不规则形等：表面指凸起或平展、有无光泽、是否光滑等；质地指粘、脆情况。对于菌落的大小，应量取其直径；对于菌落质地，可用接种针挑取，试验其粘、脆情况。

2. 菌体形态观察。细菌的菌体微小，而且大多无色透明，为了在显微镜下看清其形态，必须进行染色。细菌染色可用单染色法，其步骤方法如下：涂片：取一干净的载玻片，在其中央部位滴上一滴无菌水。然后，用无

菌操作方法，从斜面培养基上取出少许菌种，放入上述无菌水滴中，涂成均匀的菌液。

固定：将涂有菌液的载玻片在酒精灯火焰上迅速通过 2～3 次，使菌液干燥，将菌体固定在载玻片上，使其不易脱落。

染色：将结晶紫染色液（或番红染色液）滴加在干燥的涂片上，滴加量以染色液刚能覆盖涂片部分为适宜，染色时间约 1 分钟。

冲洗：用自来水缓缓冲去染色液，直至流水变清为止。干燥：将染色后的载玻片在微火上烘干。

染色以后，在显微镜油镜头下观察细菌菌体形态。观察内容主要有菌体形状和菌体排列方式。

三、开展本项活动应注意的事项

（一）培养细菌的种类

接种和培养的菌种应选择对人体无害的种类，以免引起疾病感染，即使接种、培养非病源菌，也应教育学生在接种、培养和观察过程中，双手不能接触和沾染菌体，每次操作结束后都须洗手消毒，接种针用过后要在火焰上烧灼灭菌，盛放菌种的试管、培养皿在活动结束后应清洗干净，不需要的菌体应妥善处理，不能随便丢弃。

（二）灭菌操作要一丝不苟

灭菌是本项活动成败的关键，在本项活动中，制作培养基、接种、培养、观察等方面，都须进行灭菌工作。要教育学生对灭菌工作要一丝不苟，以免因一时疏忽而功亏一篑。

（三）作好记载工作

本项活动的全部过程都应进行记载。其中，对于接种方法、培养过程和观察结果应详细记载，以便为活动总结提供原始资料。