一、基因转移方法

向动物体内转入外源基因

这一方法的尝试是从 70 年代中期开始的，到 80 年代，科学家们已经相继建立了多项转基因技术。

显微注射法这种方法是 1981 年由美国科学家戈登（Gordon）等人首先实验成功的。他们将小鼠的受精卵取出来，在显微镜下将胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的雄原核，然后立刻输入假孕母鼠的输卵管中，使其在子宫内着床，最终发育成转基因小鼠。在此后约一年多时间内，人的珠蛋白基因和胰岛素基因也被转入了小鼠。随后，生产转基因小鼠的经验迅速地被移植到生产转基因家畜上。到 1985 年，哈默（Hammer）等人首先报道用显微注射法生产出转基因兔、羊和猪。显微注射虽然是有效的方法，但转基因动物生产仍是一项困难的技术，即使具备了良好的设备和训练有素的技术人员，注射和移植一百个小鼠胚胎，仅能获得五只转基因小鼠。家畜的胚胎细胞核不易看清，不能直接注射，必须先作离心处理后才能注射，这样，生产转基因个体的机率又下降了一个数量级。鱼类和两栖类的卵是多黄卵，在显微镜下不易辨认原核，有些科学家采用基因注入卵母细胞核的方法，因为卵母细胞核大些，可以在显微镜下看见，基因可以注入卵母细胞核中，让卵母细胞体外成就并受精，最终受精卵发育成小鱼。
动物病毒载体法与显微注射法相反，动物病毒逆转录病毒对细胞染色体的整合是按照已经了解的机制准确地结合到被传染细胞的基因组中，往往只有一个单一的病毒拷贝插入到已知的染色体位点上，不易引起寄主基因组大规模的重排，只会在整合位点上的很短的一段寄主 DNA 序列上产生重排。把小鼠胚胎在子宫着床前浸泡在浓的病毒原液中，或是把它们与产生病毒的单层细胞一起培养，即可达到转基因的效果。目前，这种方法主要应用于转基因牛和转基因鸡的生产。转基因牛生产成本太高，不适宜使用大量注射和移植受精卵的方法生产。鸡蛋中的胚胎已经是多细胞胚胎，不适宜用显微注射法。到目前为止，美国科学家已用 RSV 载体生产出转基因牛，用 RV 载体生产出转基因鸡。但这个方法的缺点是对所转移的基因的大小有一定的限制，同时转移的基因在动物体内表达的问题还没有得到完满解决。
电转移法电转移法是将生殖细胞或体细胞置于电场内，同时加入待转移的外源基因，在电场作用下外源基因导入细胞内。近年来，利用电转移器将外源基因导入小鼠卵中等研究都取得了成功。这种方法操作比较简单，效果较好，但不易普及，因为电转移器较昂贵。
胚胎干细胞法胚胎干细胞是从胚泡中将内细胞团取出在体外培养建立的，在培养过程中保持了它的正常核型，胚胎干细胞注入寄主胚泡后，能掺入胚胎，并参与嵌合体动物的生殖系。利用动物病毒载体法等方法可以将外源基因导入胚胎干细胞，选出带有目的基因的细胞克隆，然后导入小鼠胚胎，这就为创造特定的预知转基因动物开拓了一条新途径。
精子载体法这项工作始于意大利，意大利科学家首先利用小鼠精子作为载体，使精子与 CAT（氯霉素乙酰转移酶）基因混合，待精子头部吸收CAT 基因后，用该精子使小鼠卵体外受精，之后移入雌鼠体内。在出生的 30

％小鼠中检出了 CAT 基因。该方法在青蛙和海胆的实验中也得到了成功。我国在这方面进展比较大，自 1989 年以来，北京农业大学与中国农科院畜牧研

究所、湖北农科院畜牧兽医研究所和新疆畜科院等单位合作，在家兔、猪、羊和牛等动物上进行了大量试验，目前已获得了转基因家兔、猪和绵羊。转基因效率达到 3％，略高于显微注射的效率。另外，我国用鱼精子作载体，把外源人生长激素基因经鲤鱼精子导入鱼卵，表达率为 50％，高表达幼苗生长速度为不表达幼苗的 2 倍。我国还成功地进行了用鸡精子导入病毒基因的实验。应该说，我国在精子载体法转移基因的研究中，是走在世界前列的。 (6)定位整合技术转基因动物技术上的最大缺点是盲目性：导入的外源

基因对受体细胞基因组的插入是随机的。因此，实现外源基因的定位整合技术（Sitedirected Integration ofGene）以及同期建立的小鼠胚胎多能干细胞系（ES 细胞系）的体外培养方法，为基因定位整合进而为哺乳动物种系改造开拓了充满希望的前景。其大意是利用 DNA 体内同源重组的原理，将外源基因稳定地插入特定的位点，再经适当的筛选，从而得到既定的转化细胞。这一技术不仅在动物育种上，而且在缺陷基因的修复上（遗传性疾病与恶性肿瘤）以及生命科学的理论研究上，都将有很大的应用价值。

向植物体内转移外源基因

开展此项研究最早是在 1985 年，之所以比动物转基因晚，除了研究热点以外，主要是因为植物细胞外有一层细胞壁，这层细胞壁给转基因带来了很大的不便。

对一个成熟、实用性强的植物转基因系统，它应该具备以下条件：获得转基因植株的效率高；重复性要好；设备要简单，易于操作；由转化至获得转基因植株的时间相对较短；无基因型的依赖性，即方法的适用范围广，能在同一个植物种的许多基因型上成功，特别是在优良的栽培品种上成功。

近年来，植物转基因的方法不断有所创新，大体可分为三类。

农杆菌介导的基因转移根癌农杆菌和发根农杆菌可以使范围很广的双子叶植物（前者）、也可使部分裸子植物分别形成冠瘿瘤和发状根（hairy root）。近年已有一些证据显示根癌农杆菌的 Ti 质粒也可向一些单子叶植物

（如石万柏、百合、薯蓣等）转移外源基因并表达。野生型根癌农杆菌的 Ti 质粒由于携带与生长素和细胞分裂素合成有关的基因，使转化的细胞产生过量的植物激素而形成肿瘤。利用这种野生型农杆菌作为基因载体，常使转化的细胞丧失分化能力。利用野生型农杆菌进行转化时，所形成的肿瘤或发状根本身即是一种天然的选择标记，在无激素的培养基上就可以获得转化细胞系。由于发根农杆菌感染后形成的发状根在很多情况下可诱导再生形成植株，以及发状根本身的单细胞起源，近年利用发根农杆菌进行转化的工作也已受到不少重视。根据所用植物材料的不同，常用的农杆菌转化方法大致可分如下三类：

①整株感染——用处于对数生长期的野生型农杆菌感染植物的受伤部位，将得到的肿瘤或发状根切下，置于含羧苄青霉素的无激素培养基上培养并杀菌，这是获得转化细胞系的最简便的方法。这一方法的优点是实验周期短、操作简便，但在用根癌农杆菌转化形成肿瘤组织时，常混有未转化的正常细胞，即形成的是嵌合体。

②叶圆片法——该方法用打孔器取得叶圆片或用解剖刀将叶切成小块，在过夜培养的农杆菌菌液中浸几秒钟到几分钟后，用滤纸吸干后在培养基上共培养 2～3 天，再转移到含抗菌素的选择培养基上培养并杀菌，再由获得的转化细胞诱导形成再生植株。这一方法已广泛用于多种植物的转化。其他各

种外植体，包括茎切段、叶柄、胚轴等以及悬浮培养的细胞均可用类似的方法进行转化。例如，在拟南芥上发展起来的利用根切段和萌发种子的转化技术，已表明有很高的转化频率。

③原生质体和农杆菌共培养法——将处于再生壁时期的原生质体（在原生质体群体中通常已可见部分已开始第一次分裂）与根癌农杆菌共培养 36～ 48 小时，分离洗涤去菌后培养在含抗菌素的选择培养基上即可得到转化的细胞克隆。与上面两种方法比较，此法得到的转化体一般不会是嵌合体。利用这一方法已使多种烟草属植物、矮牵牛、龙葵、胡萝卜等植物的细胞转化，并获得转基因植物。共培养法同样适用于发根农杆菌 Ri 质粒的 T-DNA 转移。在共培养过程中，新形成的细胞壁和一些二价阳离子为农杆菌的附着和转化所必需。当由胡萝卜悬浮培养细胞刚分离的原生质体与发根农杆菌混合时并不形成转化细胞团，发现如果将此混合物放置 2 小时后进行二次电脉冲处理，则可明显提高转化频率。

以原生质体或细胞作为受体的直接基因转移直接基因转移，是指经特殊处理后直接将 DNA 转移到植物细胞或原生质体中导致细胞转化的技术。常用的 DNA 直接转化技术可分为化学和物理方法两大类。

①利用特定的化合物诱导的 DNA 直接转移——在利用原生质体作为受体进行外源基因导入的研究中，已发现一些化合物有助于原生质体摄取外源DNA，包括 PEG（聚乙二醇）、PLO（聚-L-鸟氨酸）、磷酸钙等。聚乙二醇法是将原生质体悬浮于含有 DNA 的介质中，用分子量为 4000～6000 的 PEG 在pH8～9 下促进 DNA 的摄取，从而使细胞转化。很多因素都会影响 PEG 诱导的转化，如加入 DNA 和 PEG 的次序，是否加入了携带 DNA（carrier DNA），导入的 DNA 的形式如何，加入的 PEG 的最终浓度多少等。用经同步化处理后的烟草叶肉原生质体，已发现在细胞周期的 S 期或 M 期时的转化频率明显高于其他时期，在用 PEG 处理前用低剂量的 X 射线或紫外线处理原生质体，可使抗性细胞团增加 2～7 倍，而不影响细胞团的形成和植株再生，这可能是因多辐射使更多的细胞有效地整合外源基因。其他一些因素，如保温处理的时间，在加入 DNA 之前对原生质体的热休克处理等也有一定的影响。至今，利用 PEG 法已使多种重要的禾谷类作物，如水稻、高粱、小麦的原生质体获得了基因植物。

②利用物理方法诱导的 DNA 直接转移——这类方法的原理是基于许多物理因素均可通过对细胞膜的影响，促进外源 DNA 分子进入细胞，或通过机械损伤后直接将外源 DNA 导入细胞。常用的诱导 DNA 直接转移的物理方法有电穿孔法、微注射法、基因枪法等。

电穿孔法（electroporation）的基本原理是利用新鲜分离的原生质体在高压电脉冲作用下在质膜上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源 DNA 的摄取。有两种不同的处理方式，一种是采用较低的电压处理较长时间，另一种是采用高压电处理很短的时间。为提高转化频率，通常可把电穿孔法与 PEG 法结合起来。电穿孔法的优点是操作简便，适用于对农杆菌感染不敏感的植物，导入 DNA 的效率也特高，特别适于瞬间表达（transient expression）的研究；其缺点是易造成原生质体的损伤，使植板率降低。

利用微注射法（microinjection）进行基因导入时，通常需先把原生质或培养的细胞固定在琼脂、低熔点的琼脂糖或 alginate 中，或用聚赖氨酸处理附着在玻璃平板上，也可通过一固着的毛细管将原生质体吸着在管口，再

进行操作，即通过一极细的毛细管将一定量的 DNA 注入细胞内，甚至直接注入核内。在这方面，瑞士的诺豪斯（Neuhaus）等人已发展出一套完整的技术。用此法已在烟草、油菜、苜蓿等植物的原生质体上获得成功。微注射法的优点是转化效率高，在用线形 DNA 的一些试验中，转化效率甚至高达 60％以上，无需特殊的选择系统，并且没有农杆菌宿主范围的局限性。今年这一技术也用于培养细胞或胚性细胞团等。

基因枪法（particle gun）又称微弹法（microprojectilebombardment），其基本原理是将 DNA 包被在微小的金粉或钨粉表面，在高压的作用下高速穿透受体细胞或组织，外源 DNA 随之导入细胞，整合并表达。该方法的优点是免去了分离原生质体的麻烦，可以直接转化各种外植体、愈伤组织以及胚性细胞系。并已有证据不光可将外源 DNA 导入细胞核，而且可以转化细胞器（如叶绿体）。利用该法已由烟草、大豆、棉花、玉米等多种植物得到转化植物，目前这种方法的采用越来越广泛。

种系系统的基因转移（germ line transformation）通常利用子房注射种胚、体细胞胚以及花粉等途径导入外源基因。由于植物种类的繁多，各种植物特性的不同，无需也不可能有适用于所有植物的转化方法。因此，从不同的方面以及不同的层次上进行探索，以确定适于个别作物的高效转化方法，仍将是一个值得重视的研究课题。