二、培养基灭菌和空气除菌技术

培养基灭菌技术

在无菌的液体培养基中接入纯种的常规或重组微生物或动植物细胞—— 生物催化剂，进行大规模的细胞培养或进而进行代谢产物的生产，即发酵过程时，培养基的灭菌技术是相当重要的。此外，在酶反应过程中所用的底物溶液一般也需事先灭菌。

工业中培养基的灭菌一般都用蒸汽加热进行。灭菌所需时间与培养基及其中杂菌的性质、含菌量以及灭菌温度有关。一般情况下，可认为杂菌在热能作用下其死亡率为一级反应，即

− dN = kN (5 − 1)

式中，N 为活菌数或活菌浓度；t 为灭菌时间；k 为灭菌速率常数，与灭菌温度及杂菌种别有关，温度越高，k 值越大。

若 t＝t0 时，N＝N0（下标 0 表示初始条件），将上式积分后得

1 N

t = 2.303 k tg N

(5 − 2)

提高灭菌温度有利于迅速增加杂菌杀死速率，而大大缩短灭菌时间。温度升高后，当然也会适当增加营养物质的破坏速率，但因灭菌时间的缩短，总破坏量反比较低灭菌温度时为少。例如，当温度从 105℃升高至 130℃时，嗜热脂肪等孢杆菌的死亡速率增大 268 倍，但维生素 B1 的分解速度在同样的温度变化范围中仅增加 6.16 倍。因此工业上常采用高温快速方法进行灭菌，以保留更多的营养成分。

工业上实际使用的蒸汽灭菌方法有两种：

实罐灭菌（即分批灭菌）将配制好的培养基放入发酵罐，连同发酵罐进行灭菌。开始时蒸汽先通过夹套或蛇管间接加热，以免过多的冷凝水稀释培养基。待罐温达 80～90℃时，可直接将蒸汽通入培养基直至到达灭菌温度

（一般为 121℃，即表压为 0.1MPa）后，维持此温度 20～30 分钟。此时有关排汽阀门仍应适当开启，以使蒸汽流动通畅，并同时对附属管道灭菌。灭菌完毕后，应及时通入无菌空气使罐内维持正压，然后通过夹套或蛇管将培养基尽快冷却。

连续灭菌将配制好的并经预热（60～75℃）的培养基用泵连续输入由直接蒸汽加热的加热塔，使在短时间内达到灭菌温度（126～132℃）。然后进入维持罐（或维持管），使在灭菌温度下维持 3～7 分钟后再进入冷却管，使其冷却至接种温度并直接进入已事先灭菌（空罐灭菌）过的发酵罐内（图5-2）。

图 5-2 连续灭菌流程图

这里应特别指出的是，培养动物细胞的培养基的灭菌一般不能用热灭菌法，因其中有血清、氨基酸等易受热破坏的成分。这种培养基应采用孔径小于 0.2 微米的滤膜来除菌。

空气的除菌技术

在生物生产过程中，特别是在好气发酵过程和进行无菌操作的工作室中，都需要使用大量无菌空气。

工业上大规模的无菌空气是用过滤方法获得的。用于空气除菌的过滤器有两大类，即早期采用的深层过滤法和后来发展起来的绝对过滤法。前者指以活性炭等颗粒介质和棉花、玻璃棉、合成纤维等纤维状介质堆积或装填的填充床过滤器，或纸质滤片、石棉滤板过滤器，进行空气过滤；后者指利用高分子材料、烧结金属或陶瓷制成的微孔滤膜进行空气过滤。

采用孔径在 0.2 微米左右的滤膜的绝对过滤法能达到“绝对”除菌的效果。例如，用聚四氟乙烯微孔滤膜制成滤管式空气过滤器（图 5-3），能耐蒸汽灭菌，又因其为疏水性而能防御湿空气，再因其孔隙率可高达 85％，因此空气通过后的压力降也很低。由于微孔很易被堵塞，因此在微孔膜的外表应用孔径较大的过滤材料覆盖，并串联前过滤器，以免空气中的较大颗粒尘埃或夹带的铁锈等杂物对微孔的损害。使用一段时间后，可用无菌空气反吹，以延长使用寿命。我国现使用较多的是烧结镍合金制成的滤管过滤器，孔径虽不太标准化，效果也不错。但上述过滤器价值昂贵，对设备维护的要求较高，有的还需进口，因此深层过滤器还在生产上使用。

图 5-3 滤管式空气过滤器

不论采用何种过滤方法，空气应先经过预处理，使其具有一定压力、温度、湿度并尽量去除其中的尘埃和杂菌。空气预处理的流程大致如图 5-4 所示。首先是空气压缩机将大气中的空气吸入并压缩至一定压力（约 0.25MPa 左右），此时空气因受压而产热升温（约为 80～120℃），因此需以冷却。冷却的程度应适当控制，因压缩空气的露点（即空气中的水汽开始达到饱和而析出水分时的温度）比常压下的空气为高。因此要么就把它冷却到露点以上，进入空气过滤器；要不然就让它冷却到露点以下，让它析出一定的水分并充分把水分去除，然后再把析去水分但相对湿度为 100％的空气适当加热

（约升高 5～10℃），使其相对湿度为 60％左右，再进入空气过滤器。最不好的情况是把压缩空气冷却到露点以下，既不析水又不加温而直接进入空气过滤器，这时棉花、玻璃棉或滤纸等过滤介质就会受潮积水丧失过滤能力，压力降也大为增加，并成为杂菌繁殖的温床，除菌器便成为增菌器了。

在压缩空气冷却至露点以下时，空气中部分水汽凝结为水滴，空气的绝对含水量为之下降。析出的水滴必须采用旋风分离器和丝网除滴器加以去除。否则当空气在加温时，水滴又汽化为水汽，达不到预期降低相对湿度的目的。

图 5-4 空气预处理流程图

还在生产上使用的深层过滤器，所采用的介质通常是纤维状物质。当纤维以一定填充密度置于过滤器时，其空隙一般要大于 50 微米，即远大于微生物的大小（球菌的直径约为 0.5～1 微米）。因此在这种过滤器中的除菌不是真正的“过滤”，而是靠惯性、拦截、扩散、静电等作用除菌。滤纸的孔隙一般也超过 0.5 微米，为此也应属深层过滤的范畴。所谓惯性作用是指空气中的颗粒随着空气的高速运动而运动，并凭借颗粒本身的质量较空气为大，

在接近介质时不像空气那样绕过介质，而是靠惯性继续前进并撞击在介质上而被去除。拦截作用是指部分正对着介质的颗粒随着空气流前进而被介质所拦截。扩散作用是指小于 1 微米的颗粒所产生的布朗运动而形成的扩散，当颗粒遇到介质后被去除。静电作用是指当颗粒与介质间具有不同电荷时的静电吸引作用，细菌表面常带负电荷。介质除菌是上述四种作用的综合作用，也可说总除菌效率是这四种除菌效率之和。

在以上四种除菌作用中，惯性和拦截作用随气流速度增大而加强，而扩散和静电作用则随气流速度减小而减弱。因此，若将总除菌效率（实际上是指单纤维捕集效率η0）对气流速度ωg 作标绘时，可得一具有最低值的曲线

（图 5-5），此流速称为临界流速（ωg）c0。图 5-5 不同气流速度下的单纤维捕集效率

若从提高过滤效率着想，空气过滤器的设计和操作应选择较高的气流速

度。但这样做，会导致两个问题，一是当实际用气量低于设计用气量时，过滤器的除菌效率就会下降而达不到预期的效果，并可能引起发酵的杂菌污染；二是会导致很大的压力降，因通过过滤介质的压力降是随着气流速度的平方值而增加的。为此在设计空气过滤器时采用临界气流值是较为安全和合理的。

在用棉花为过滤介质时，应采用未经脱脂的棉花。其直径约为 16～20 微米，长度约为 2～3 厘米，实密度为 1520 千克/米 3，填充密度可为 130～ 150 千克/米 3，故其填充率为 8.5％～10％。在采用玻璃棉时，应采用无碱玻璃棉。直径用 10～20 微米的较好，实密度为 2600 千克/米 3，填充密度可为 130～280 千克/米 3，折算成填充率为 5％～11％。